大家好！上一篇我们讲了富集分析中如何选择数据库，也提到有时需要根据研究领域自建特定的基因集。这一篇我们来讲富集分析的另一个重要决策：用什么方法做富集分析。
无论用哪种方法，富集分析要做的事情都是一样的：把基因层面的结果，转化为通路、生物学过程等功能层面的描述。不同方法的区别在于：用了数据中的哪些信息，以及用什么方式判断"富集"。
最常用的方法有两大类：ORA 和 GSEA。此外，还有一类以单个样本为单位的打分方法，如 ssGSEA、GSVA。这几类方法没有绝对的优劣，只有各自适用的场景。
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ORA（Over-Representation Analysis，过表达分析）是最基础的方法：把我们关注的基因列表，与数据库中的每个基因集取交集，再用统计检验判断这个交集是否比随机情况下预期的更多。具体原理在上一篇中已经介绍过。
ORA 的核心特点是：只需要一个基因列表。这带来两个好处：
1. 基因集来源不受限制。 列表不一定来自组间比较的表达数据，任何实验得到的基因、蛋白或代谢物列表都可以分析，例如：
2. 统计逻辑简单，结果可以追溯到具体基因。 ORA 检验的就是"列表与某个基因集的交集，是否比随机抽取时预期的更多"。和 GSEA 的排序、置换检验相比，这个逻辑更容易理解。结果中也可以直接看到是列表里的哪几个基因落在了这个条目中，方便回到具体基因做下一步验证。
ORA 的局限主要有两点：
1. 结果依赖阈值。 以转录组测序为例，做 ORA 之前必须先设阈值筛选差异基因。用 |log2FC| > 0.5、P < 0.05 和用 |log2FC| > 1、P < 0.05 得到的基因列表不同，富集结果也可能不同。阈值筛选还会带来两个问题：
- 变化幅度较小的基因会被直接舍弃。如果某条通路里的很多基因都只是小幅变化，ORA 很可能检测不到这条通路。
- 如果处理比较温和，差异基因本身就不多（比如只有一两百个），富集结果往往不显著或不稳定。
2. 方向难以判断。 按阈值筛选时，我们通常会得到上调、下调两个基因列表，分别做富集分析。如果某个条目在上调和下调中都富集到了，就很难判断这个生物学过程整体是被激活还是被抑制。
这些局限，引出了第二种方法：GSEA。
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GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）需要两个维度的输入：
- 每个基因的变化倍数或统计量（如 log2FC），这是 ORA 不用的信息。GSEA 按这个指标给所有基因排序，并把它作为权重：变化幅度越大的基因，对结果的贡献越大。
GSEA 的第一个好处是不需要阈值。 比如按阈值筛选，你可能得到上调 300 个、下调 200 个基因；而 GSEA 会把检测到的所有基因都纳入分析，看某个基因集的基因在整个排序中是整体偏向前端（上调）还是后端（下调）。所以即使单个基因的变化都不大，只要同一个基因集里的许多基因朝同一个方向变化，GSEA 也能检测到。
GSEA 早期的奠基性工作（Mootha 等，2003）正是在糖尿病患者的肌肉组织中发现，氧化磷酸化相关基因的表达平均只下降了约 20%，单个基因都达不到显著水平，但作为一个整体呈现一致的下调。
第二个好处是方向明确。 GSEA 对每个基因集只给出一个方向：以处理组相对对照组排序时，NES > 0 表示整体上调，NES < 0 表示整体下调。它不会把基因集拆成上调、下调两部分分别看。需要注意的是，如果一个基因集里上调和下调的基因数量相当，GSEA 通常不会给出显著结果。这本身也是一种信息：说明这条通路并没有整体朝一个方向变化。
当然，GSEA 也有局限：
1. 需要每个基因的变化信息。 如果你手上只有一个基因列表（比如 Co-IP 质谱得到的互作蛋白），没有变化倍数或统计量可以用来排序，就无法做 GSEA。
2. 需要以全部检测到的基因作为输入。 GSEA 的排序应该覆盖所有检测到的基因，而不是筛选后的差异基因。如果只把几百个差异基因拿去排序，就失去了 GSEA 不依赖阈值的意义。另外，如果检测平台本身覆盖的基因就少（比如靶向测序 panel），和数据库基因集重叠的基因也少，很多基因集会因为达不到软件设定的最小基因数（常见默认值为 10 或 15）而被过滤掉，统计效力也会下降。
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单样本打分：关注每个样本的通路活性。前两种方法关注的通常是 A 与 B 的比较，即处理组 vs 对照组（当然，ORA 的基因列表也可能来自其他类型的实验）。
但有时我们需要另一类方法：不预先给样本分组，而是针对某条感兴趣的通路或生物学过程，计算它在每个样本中的活性。常用的方法有 ssGSEA、GSVA，单细胞数据中常用 AUCell 等。
以肿瘤队列为例，流程大致如下：
- 选取通路：比如关注铁死亡，可以用 KEGG 中的 Ferroptosis 通路（hsa04216），也可以按上一篇介绍的思路自建基因集；
- 样本打分：根据通路内基因在每个样本中的表达情况，给每个样本算一个分数；
- 样本分组：按分数高低把患者分成高、低（或高、中、低）活性组，或者直接从这个维度去理解患者之间的异质性。
这类方法的前提是多样本数据：十几、几十、上百例的队列，或单细胞数据中成千上万个细胞。如果只有处理组、对照组各 3 个样本，通常不会用这类方法。
在多样本队列中，打分把所关注的通路、生物学过程或基因集量化成了一个指标。这个指标可以和队列中的其他信息做关联分析，例如：
比如你想知道铁死亡是否和肿瘤耐药有关，可以分析铁死亡评分与药物敏感性指标之间的相关性。在这个过程中，你没有预先把样本分成 A 组和 B 组，而是从每个样本的评分出发，建立生物学过程和临床表型之间的联系。
这类方法的边界主要有以下几点：
1. 适用于多样本，不适用于简单的两组比较。 如果只是处理组和对照组的少量样本，用 GSEA 更直接。
2. 打分本身不是检验。 它只是把基因表达转换成通路分数，不判断组间差异是否显著。后面还需要结合统计检验、生存分析、相关分析等。
3. 分数的含义取决于基因集的组成。 打分反映的是基因集内基因的整体表达水平，不等同于通路真实的活性。如果基因集里同时有促进和抑制这个过程的基因，分数高不一定代表这个过程更活跃。这时可以考虑把基因集拆成促进、抑制两部分分别打分。
4. 分数是相对的。 以 GSVA 为例，打分时会参考同一次分析中所有样本的表达分布，所以分数只在同一次分析的样本之间可比。更换或合并队列后，同一个样本的分数可能会变。
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最后我们讨论一下如何选择富集方法
第一步：除了基因列表，还有什么信息？
- 如果只有一个基因列表，既没有每个基因的变化值，也不来自组间比较（例如 Co-IP 质谱的互作蛋白、ChIP-seq 的靶基因），用 ORA即可。
第二步：样本情况和分析目的是什么？
- 样本只有处理组和对照组，关心的是两组之间的差异：用 ORA 或 GSEA，进入第三步。这种情况不需要做单样本打分。
- 样本是多样本队列或单细胞数据，关心的是每个样本（或细胞）的特征，或者想把通路活性与生存、临床指标等做关联：用 ssGSEA、GSVA 或 AUCell。
第三步：做组间比较时，选 ORA 还是 GSEA？
- 所有检测到的基因都有变化倍数或统计量：可以同时做GSEA和ORA。
方法本身没有优劣之分。先弄清楚自己手里有什么数据、想回答什么问题，再选择对应的方法；在设计实验时，也可以提前想好后续要用哪种富集方法，并据此安排样本量和检测方案。
