同一段mRNA上，可以选出很多条与目标完全互补的siRNA候选。但做过筛选就会发现，它们的效果可能差得很远。

设计软件通常会给出GC含量、末端稳定性、二级结构、自由能和脱靶评分。有的候选GC合适，却被结构筛选排除了；有的整体评分不错，seed相关风险又比较高。

这些参数分别在检查什么？为什么这样筛？数值越高越好，还是越低越好？

这篇集中讨论常规合成siRNA的序列选择。默认目标序列已经确认，直接从长度、碱基组成和结构讲起。

文中的引导链，指预期识别目标RNA的反义链；另一条为乘客链。涉及位置编号时，均从相应链的5′端开始。

01｜长度：为什么常见的是19 bp双链区？

常见的siRNA由19 bp配对区和两条链各自的2 nt 3′突出端组成，因此每条链总长为21 nt。

19 bp描述两条链之间的配对长度，21 nt描述一条链的总长度。订购表里的“19 nt＋dTdT”，通常对应这一类结构。

这种长度与RNA干扰通路对短双链RNA的识别和装载相适应。早期研究已经证明，21 nt siRNA双链能够在哺乳动物细胞中介导序列特异性的基因沉默。[1]

既然需要与目标互补，为什么不直接做得更长？

因为长度增加时，变化的不只是结合强度，还包括双链的加工方式，以及最终进入RISC的RNA产物。

常规短siRNA可以在不依赖Dicer进一步切割的情况下发挥作用。更长的Dicer底物RNA，则需要考虑加工后的链长和末端。研究中确实有25–30 nt的Dicer底物方案，部分表现优于对应的传统siRNA，但不能把任何19 nt候选简单延长，就认为活性会提高。[2]

因此，比较候选之前，应固定分子结构。传统短siRNA、非对称双链和Dicer底物，可以采用不同的设计规则，不宜放进同一张评分表直接排名。

突出端也需要保留原有定义。dTdT是两个脱氧胸苷，UU是两个尿苷，不能把它们当作无关紧要的尾巴随意替换。

02｜GC含量：为什么通常优先选中等GC？

GC含量的计算很简单：

GC含量＝G和C的数量÷所统计的序列长度×100%。

对于19 nt配对区：

• 7个G/C，约为36.8%；

• 8个G/C，约为42.1%；

• 10个G/C，约为52.6%。

计算时应说明统计的是配对区，还是包含突出端的完整链。否则，同一条siRNA也可能得到不同的GC百分比。

GC组成会影响RNA双链的稳定性。这种影响还涉及相邻碱基的堆积，不能只用GC和AU的氢键数量解释全部差异。

GC较高的序列可能形成较稳定的双链或局部结构，影响链选择、结构重排及靶区接近。GC很低时，则需要评估配对稳定性、序列复杂度等条件。

Reynolds等人的经典研究，将30%–52%的GC含量列为有利评分条件之一。[3] 因此，40%并不是所有siRNA共同的最低合格线。

实际筛选中，可以优先考虑中等GC的候选，但不必因为36.8%低于40%就将其删除；52.6%略高于某套经验范围，也不能直接判定无效。

GC适合用于初筛，不能单独决定一条序列的去留。

尤其不要为了凑到某个百分比，主动改掉原本与目标匹配的碱基。

03｜末端不对称性：同样的GC，为什么效果可能不同？

假设两条siRNA的GC都是42.1%。

第一条的GC主要分布在引导链中后段，引导链5′端附近相对富含A/U；第二条恰好相反，GC集中在引导链5′端附近。

总GC相同，双链两端的稳定性却可能不同。

siRNA装载时，两条链成为引导链的机会会受到末端结构影响。经典研究发现，两个5′端附近配对的绝对稳定性和相对稳定性，都与链选择有关。[4]

常规设计通常希望：预期引导链5′端所在的双链末端，相对更容易打开。

这里比较的是双链的两个物理末端。引导链5′端所在的一端，同时对应乘客链的3′端。不能把两条链都按5′→3′从左到右排列后，直接比较图上的左侧。

软件可能计算末端若干碱基对的自由能。例如，在相同条件下，一端为−3 kcal/mol，另一端为−7 kcal/mol，后者形成配对在热力学上更有利。

如果−3 kcal/mol对应预期引导链的5′端，这种相对差异可能更符合常见的链选择偏好。

这只是解释数值方向的假设例子，并非推荐阈值。计算3个、4个或更多末端碱基对，结果不能直接混用。

不同软件还可能采用相反的差值定义。看到末端ΔΔG为正或为负，需要核对它减的是哪一端，不能只记一个符号。

04｜位置偏好：为什么某一位最好是A或U？

不少算法会检查特定位置的碱基。

例如Ui-Tei等人的规则，包括反义链5′端为A/U、正义链5′端为G/C，以及反义链5′端区域相对富含A/U。[5] 这些条件与末端稳定性和链选择存在联系。

另一些条件来自对候选活性的统计分析。例如Reynolds规则中包含正义链第3位、第19位偏好A，第10位偏好U等条件。[3]

使用时，有两个地方容易出错。

一个是链方向。

正义链第19位和反义链第19位，指向的不是同一个位置。检查参数表时，需要同时确认链方向、编号起点，以及是否包含突出端。

另一个是把统计偏好当成必需条件。

某个位点偏好A，表示它在特定研究数据中与较高活性相关，不能推导出该位点为G的siRNA一定无效。不同位置的偏好，也未必都已有明确、独立的机制解释。

这类参数更适合参与综合评分。把几套算法的全部偏好拼在一起，要求候选同时满足所有条件，可能会筛掉值得测试的序列。

如果某个位点不符合偏好，可以换一个靶位点寻找候选，而不是直接改碱基，制造与目标RNA的错配。

05｜连续碱基和重复序列：为什么经常被过滤？

AAAA、GGGG、反复出现的AU或GC，往往会在设计软件中被标记。

这些情况需要分别判断。

连续G/C或局部GC富集，可能使某段配对特别稳定。简单重复和低复杂度序列，则可能在多个RNA中出现相似片段，增加特异性筛查的困难。

但连续相同碱基，并不会自动形成稳定发夹。

例如，一段GGGG还需要与序列中的其他区域形成合适的内部配对，才可能构成发夹的一部分。反过来，没有连续相同碱基的序列，也可能具有较强自互补。

因此，连续碱基过滤和二级结构预测应分别进行。

一些流程把连续4个相同碱基设为排除条件，也有规则使用不同阈值。这些可以作为缩小候选范围的经验设置，但不能统一解释为一旦超过就必然失效。

如果序列后续还要用于U6等RNA聚合酶III启动子驱动的shRNA，需要额外考虑连续T序列带来的提前终止风险。这个原因适用于相应表达体系，不能直接拿来解释化学合成siRNA中的连续U为何无效。

06｜siRNA自身的二级结构：为什么要检查自互补？

siRNA两条链之间需要形成互补双链。设计中检查的自互补，主要指一条链内部的不同片段能否互相配对。

例如，引导链前端与后端存在较强互补，就可能形成内部茎环结构。

Patzel等人的研究观察到，在其测试体系中，引导链较强的二级结构形成倾向与较低沉默活性相关，末端参与内部配对的结构尤其值得注意。[6]

不过，游离RNA单链的折叠预测，无法完整还原它在RISC中的状态。siRNA装载、乘客链去除，以及引导链与蛋白结合，都可能改变结构。

不能把一张预测发夹图，直接解释为引导链在细胞内始终被锁住。

查看结构结果时，可以关注：

• 是否存在较长、较稳定的内部配对；

• 5′端或seed区域是否参与配对；

• 最低自由能结构是否具有代表性；

• 是否还存在概率较高的其他构象。

RNAfold等工具既能输出最低自由能结构，也能计算结构集合及碱基配对概率。最低自由能结构只是模型给出的一个状态，其他近似稳定的构象也可能存在。

输入和参数也要统一。如果使用普通RNA模型，dTdT和化学修饰不能都按未修饰RNA直接处理。缺少相应热力学参数时，计算结果只能作为近似参考。

对于自折叠ΔG，也没有适用于所有链长、软件和修饰体系的统一淘汰线。候选间比较，比脱离条件记住一个阈值更有意义。

07｜靶RNA二级结构：完全互补，为什么还可能不好结合？

上一节检查siRNA自身，这一节需要看目标RNA。

如果靶序列已经与上下游RNA形成稳定配对，引导链识别它时，就可能需要伴随局部结构重排。即使序列完全互补，也可能因靶区可及性不同而出现活性差异。

Overhoff等人的研究通过结构分析和实验，观察到局部靶区可及性对siRNA活性的影响。[7] 后续RNAxs相关研究，也将可及性用于候选筛选。[8]

这部分可以看两个参数。

未配对概率。

它描述某个碱基或一段连续碱基，在预测结构集合中处于未配对状态的概率。

需要区分各个碱基平均的未配对概率，以及整段区域同时未配对的概率。两者是不同的统计量，不能直接替换。

开放代价。

一些算法会把未配对概率转换成能量形式，描述目标区域处于开放状态的热力学代价。在相同计算条件下，代价较低的区域通常更容易处于可接近状态。

但它不是实验测出的解链速度，也不是RISC需要消耗多少ATP。RNAplfold的文档还特别说明，其相关输出不能简单理解为展开该区域所需的平均能量。

预测时，也不能只截取靶点的19 nt单独折叠，因为这段序列可能与更远的上下游区域配对。

分析窗口、允许的最大配对跨度和温度，都会影响结果。比较候选时，应使用一致设置；如果更换窗口后排名变化很大，也应记录这种不确定性。

细胞内的RNA还会受到蛋白结合、翻译活动等因素影响。因此，可及性预测适合辅助排序，不宜仅凭一张结构图决定候选必然有效或无效。

08｜ΔG和Tm：为什么不能统一追求越低或越高？

设计结果里，可能同时出现好几个ΔG。它们虽然都以自由能表示，却描述不同过程。

对于形成配对或折叠的过程，在同一模型和条件下，ΔG越负，通常表示该过程在热力学上越有利。

因此，自折叠ΔG为−8 kcal/mol，并不会因为比−2 kcal/mol更低，就自动成为更好的候选。它可能意味着更稳定的内部结构。

Tm描述热解离特征。对于常见双链两态模型，它对应一定浓度和溶液条件下约一半双链解离的温度。Tm较高通常提示该条件下双链更耐热，但不能直接换算成细胞中的沉默效率。

比较前需要确认：算的是谁，使用什么模型，温度、盐条件和链浓度是否一致。

对经过修饰的siRNA，如果软件仍采用未修饰RNA参数，得到的数值不能当作实际分子的精确热力学性质。

09｜seed稳定性：只有7个碱基，为什么也要单独计算？

引导链5′端第2–8位通常被称为seed区域。

它参与目标识别，也可能与其他RNA的局部序列配对，产生类似miRNA的非目标调控。

Jackson等人的研究发现，很多被siRNA非预期下调的转录本，其3′UTR与引导链seed存在互补。[9] 因此，整条siRNA没有明显的近乎完全匹配，也不能排除seed相关作用。

设计中可以检查seed的碱基组成、与互补序列形成双链的稳定性，以及非目标RNA中互补位点的分布。乘客链如果参与装载，其seed也可能带来风险。

siDirect 2.0采用过seed–靶序列双链Tm低于21.5℃的筛选条件，以降低seed依赖的非目标沉默风险。[10]

这个参数有三个容易误读的地方。

首先，21.5℃指该算法条件下计算的seed双链Tm，不是完整siRNA的Tm。

其次，短seed在转录组中出现互补位点很常见，不能要求每条候选的seed都完全找不到匹配。

另外，低seed Tm和低命中次数是不同指标。某个seed即使形成配对较弱，也可能在许多转录本中出现互补位点。

seed参数可以帮助降低风险，不能单独证明没有脱靶。

10｜错配数量和位置：差2个碱基，就一定不会作用吗？

假设两条非目标RNA与siRNA都存在两个错配。

第一条的错配集中在引导链3′端附近；第二条的错配位于中央区域。数量相同，配对方式和对切割的影响却可能不同。

Ago2介导的典型切割，发生在靶RNA上与引导链第10、11位相对的位置之间。中央区域的配对有助于形成适合切割的构象，因此这一带的错配往往更值得关注。

但错配效应还取决于碱基类型和周围序列。

Du等人对单碱基错配靶点的系统分析显示，错配的位置和组成都会影响沉默，部分不完全配对仍能被容忍。[11]

筛查近似匹配时，应同时查看：

• 总错配数量；

• 错配位于seed、中央还是末端；

• 是否存在较长的连续匹配；

• 是否涉及G等非标准配对；

• 使用的工具是否考虑缺口或局部鼓包。

不能给出两个错配一定安全这样的统一结论。

即使中央错配影响了典型切割，也仍需考虑seed相关的非切割型调控。因此，长范围配对筛查和seed筛查需要分别保留。

参数互相矛盾时，怎么选？

实际筛选时，很少有一条候选在所有参数上都表现最好。

有的GC合适，但靶区预测结构较稳定；有的引导链自身不容易折叠，末端稳定性却偏向另一条链；还有的活性评分很高，但与其他转录本存在需要关注的近似匹配。

不同参数带来的问题，处理方式也不同。

非目标RNA的高度互补需要单独评估。 如果某条候选可能同时干扰另一个基因，尤其与当前表型有关的基因，应优先寻找替代位点。较好的GC和末端结构，不能抵消这一风险。

经验范围的轻微偏离，可以结合其他条件保留。 例如GC为52.6%，略高于某套规则的上限，但末端稳定性、结构和特异性表现较好，就不必仅凭这一项删除。

结构预测的不利结果，需要考虑可信程度。 靶区在一张最低自由能结构图中位于茎部，并不足以证明它在细胞内始终无法接近。还可以检查配对概率、其他构象，以及结果对分析窗口的敏感程度。

下面是一组仅用于解释筛选思路的虚构候选。假设三条都完整匹配目标，采用相同计算条件，不涉及实际敲降数据。

只看GC，A很容易排在前面。

加入其他参数后，B也值得优先测试。它的GC略高于某套经验范围，但没有必要因此放弃其他较有利的条件。

A可以保留，进一步检查局部结构预测是否稳定。C需要处理的主要问题，则是链选择偏向和非目标匹配，36.8%的GC并不是决定性缺点。

这些判断只用于安排筛选顺序，不能据此给候选预填敲降率。

此外，部分参数相互关联。GC、双链ΔG和Tm都受到碱基组成影响；5′端A/U偏好与末端稳定性也有重叠。

如果自行建立评分表，把这些指标分别赋予很高权重，可能会重复奖励同一种序列特征。没有经过实验数据校准的总分，适合帮助整理候选，不宜解释为成功概率。

设计时，可以保存这张参数表

实际记录时，除了数值，还可以给每条候选留一栏简短说明：

为什么保留，有什么顾虑，哪个参数需要结合实验再判断。

例如：GC略高于当前初筛范围，但末端结构较合适，未触发预设脱靶排除条件，保留测试。

或者：总评分较高，但与非目标转录本存在较长范围互补，暂不进入首轮。

这样的记录，比只留下一个综合分数更方便复查。

写在最后

siRNA设计中的参数，分别涉及分子结构、链选择、靶点接近和非目标识别。一个指标表现较好，不能代替其他环节的检查。

GC合适以后，还要看它分布在哪里；序列完全互补以后，还要看靶区是否容易接近；完整序列没有明显非目标命中以后，还要检查seed相关风险。

筛选得到几条候选时，可以尽量保留不同位点、不同seed，并记录各自的取舍理由。后续分别测试，才能判断哪些设计特征在当前体系中更有参考价值。

设计规则帮助缩小筛选范围，实验结果决定哪些候选能够继续使用。

下次看到设计报告里的GC、ΔG、Tm或结构评分，可以多核对一句：这个数值描述的是哪个过程，为什么会影响这条siRNA的选择？

参考文献

1. Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001;411:494–498. doi:10.1038/35078107.

2. Kim DH, Behlke MA, Rose SD, et al. Synthetic dsRNA Dicer substrates enhance RNAi potency and efficacy. Nature Biotechnology. 2005;23:222–226. doi:10.1038/nbt1051.

3. Reynolds A, Leake D, Boese Q, et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nature Biotechnology. 2004;22:326–330. doi:10.1038/nbt936.

4. Schwarz DS, Hutvágner G, Du T, et al. Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell. 2003;115:199–208. doi:10.1016/S0092-8674(03)00759-1.

5. Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, et al. Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference. Nucleic Acids Research. 2004;32:936–948. doi:10.1093/nar/gkh247.

6. Patzel V, Rutz S, Dietrich I, et al. Design of siRNAs producing unstructured guide-RNAs results in improved RNA interference efficiency. Nature Biotechnology. 2005;23:1440–1444. doi:10.1038/nbt1151.

7. Overhoff M, Alken M, Far RK, et al. Local RNA target structure influences siRNA efficacy: a systematic global analysis. Journal of Molecular Biology. 2005;348:871–881. doi:10.1016/j.jmb.2005.03.012.

8. Tafer H, Ameres SL, Obernosterer G, et al. The impact of target site accessibility on the design of effective siRNAs. Nature Biotechnology. 2008;26:578–583. doi:10.1038/nbt1404.

9. Jackson AL, Burchard J, Schelter J, et al. Widespread siRNA “off-target” transcript silencing mediated by seed region sequence complementarity. RNA. 2006;12:1179–1187. doi:10.1261/rna.25706.

10. Naito Y, Yoshimura J, Morishita S, Ui-Tei K. siDirect 2.0: updated software for designing functional siRNA with reduced seed-dependent off-target effect. BMC Bioinformatics. 2009;10:392. doi:10.1186/1471-2105-10-392.

11. Du Q, Thonberg H, Wang J, et al. A systematic analysis of the silencing effects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites. Nucleic Acids Research. 2005;33:1671–1677. doi:10.1093/nar/gki312.