做激酶研究，最怕的不是没方法，而是方法选错：钱花了、时间搭了、结果假阳性，或者根本测不到生理相关。
别慌。其实先回答三个问题：测催化活性、磷酸化水平，还是靶点结合？纯化蛋白还是复杂样本？高通量还是高可靠性？ 想清楚，方法自然清晰。
01 先分清 4 类检测目标
① 催化活性——它到底干没干活？直接或间接检测 ATP 的 γ-磷酸基团转移到蛋白质/多肽底物上。代表：放射性、发光、荧光、迁移率变动、SPA、实时荧光肽。
② 磷酸化水平或位点——活干完了没？干在哪了？检测底物是否被磷酸化，或具体哪个氨基酸被磷酸化。代表：免疫分析法、质谱法。
③ 细胞水平检测——在真实工作环境里看表现在活细胞或复杂样本中评估激酶通路变化，更接近生理状态，但通常是间接指标。
④ 靶点结合检测——它有没有跟目标握手？检测化合物是否与激酶直接结合，不直接反映催化活性。代表：SPR、CETSA、NanoBRET。
02 一张场景决策表
03 常见组合策略
实际研究中，往往不是只用一种方法，而是组合使用：
初筛：ADP-Glo、TR-FRET、迁移率变动法、AlphaScreen，快速找出活性化合物。
复筛/验证：放射性同位素法或免疫分析法，确认活性可靠性。
机制研究：质谱法定位磷酸化位点，实时荧光肽法研究动力学。
靶点结合验证：SPR 获取动力学参数，CETSA 验证细胞内结合。
细胞效应：Western Blot、ELISA、报告基因、NanoBRET™，评估细胞内通路变化。
04 避坑提醒
磷酸化状态 ≠ 激酶催化活性。
荧光法最大坑是化合物荧光干扰。
Kinase-Glo 需较高 ATP 消耗；低转化率激酶优先 ADP-Glo。
迁移率变动法只能用肽底物，不能使用完整蛋白质底物。
AlphaScreen 注意钩状效应。
NanoBRET 示踪剂多为 ATP 竞争性，高 ATP 靶点可能窗口差。
CETSA 不是所有蛋白都有热位移，膜蛋白尤其困难。
SPR 通常固定激酶，注意 DMSO 浓度、流速和再生条件。
05 下篇预告
下一篇详细拆解：放射性、荧光、发光、迁移率、SPA、实时荧光肽、免疫、质谱，各自原理、优缺点和适用场景。
你正在做哪类激酶研究？高通量筛选、机制探索，还是细胞通路验证？欢迎留言，我帮你选方法。
