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有奖互动丨CHO细胞整合位点分析怎么选方法?6大方法对比与策略拆解

更新时间 2026-09-29 11:27:01

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是生物制药行业生产治疗性重组蛋白广泛使用的表达系统。然而，CHO细胞是永生化细胞系，具有较高程度的遗传可塑性。在这种固有的遗传波动背景下，重组CHO细胞中表达的外源转基因可能发生遗传改变，从而影响转基因的完整性和稳定性，最终影响药物物质的生产。因此，对整合转基因的完整性和稳定性进行表征，是CHO细胞株开发的基础性工作。

稳定细胞株开发通常遵循以下流程：将携带目的基因的表达载体转入CHO宿主细胞 → 通过筛选标记富集稳定整合的细胞群体 → 单细胞克隆 → 扩增并评估候选克隆的生产产量、产品质量和遗传稳定性 → 建立主细胞库（MCB）和工作细胞库（WCB）。在这一流程中，整合位点分析贯穿始终，是确保细胞株质量的关键环节。

本期推文文末，我们将继续带来有奖互动小游戏，欢迎积极参与！

一

为什么要做整合位点分析？

产量方面

外源基因整合到基因组不同位置会面临不同的“位置效应”（position effect）。整合在转录活跃的开放染色质区域通常可获得更高的目的基因表达水平，而整合在异染色质区域则可能导致基因沉默。准确了解整合位点，有助于筛选高产的候选克隆。

稳定性方面

整合位点的基因组环境直接影响转基因在长期传代中的稳定性。某些基因组区域（如重复序列富集区、脆性位点）易发生重组或丢失，导致生产不稳定性。通过整合位点分析可评估细胞株在传代过程中的遗传稳定性风险。

单克隆性方面

监管机构要求生产用细胞株应来源于单个祖先细胞。整合位点分析可作为证明单克隆性的重要手段——若MCB中所有细胞呈现相同的整合位点模式，则为单克隆来源的有力证据。

监管申报方面

ICH Q5B和Q5D等指导原则明确要求对生产用细胞株进行遗传表征，包括转基因拷贝数、整合位点和结构完整性分析。

二

整合位点分析的六大方法

2.1

Southern blot

原理：Southern blot是经典的DNA印迹杂交技术。提取CHO基因组DNA后，用特定的限制性内切酶进行酶切消化，经琼脂糖凝胶电泳分离，将DNA片段转移至尼龙膜上，再以标记的外源基因特异性探针进行杂交，通过显色或化学发光检测获得包含目的基因的DNA片段大小及条带模式。条带数量反映整合位点数目，条带位置和强度反映整合状态和拷贝数。

示意图：图片由AI生成

监管申报的“金标准”：

Southern blot被公认为评估转基因完整性和稳定性的金标准方法，是监管申报中遗传表征的必要前提。传统的Southern blot分析耗时较长，需要多轮筛选合适的限制性内切酶以确保获得高质量的条带模式。

2.2

FISH（单色与多色）

原理：荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH）利用荧光标记的核酸探针与中期染色体或间期细胞核上的靶DNA序列进行互补杂交，通过荧光显微镜直接观察外源基因在染色体上的物理位置。

示意图：图片由AI生成

单色FISH——染色体水平定位整合位点

使用单一荧光标记的外源基因探针，可在单细胞水平直接可视化整合位点的染色体定位，区分单拷贝与多拷贝整合，1-2天内完成检测。一项研究利用FISH和G显带分析了45个携带载体的CHO-S克隆，发现外源基因整合到三条染色体上，其中整合到1号染色体q13带的克隆具有更高的蛋白产量和更好的传代稳定性。

示意图：图片由AI生成

多色FISH（M-FISH）——复杂核型与多整合位点的全景分析

使用多种不同荧光染料标记的探针组合，可同时检测多个染色体靶点。对核型不稳定、存在染色体易位的CHO细胞尤其适用。M-FISH分析还可用于评估细胞群的克隆性——若MCB中所有FISH模式一致，则为单克隆来源；若出现两种及以上不同模式，则提示非克隆来源或传代中发生染色体重排。

图片来源：2015 PDA reciprocal translocation observed in end-of-production cells of a commercial CHO-based process

2.3

Junction PCR

是指一条引物设计在外源插入的DNA片段（如转基因、基因敲入的荧光标记等）内部。另一条引物则设计在宿主基因组上，且位于预期插入位点的外部。只有当外源DNA片段按照设计精确地整合到基因组的目标位置时，这两条引物在空间上才会足够接近，从而通过PCR反应扩增出一条跨越连接点（junction）的特异性DNA条带。若未发生整合或整合在别处，则不会产生预期的PCR产物。

示意图：图片由AI生成

PCR方法的共同优势与不足

PCR-based方法的共同优势是操作简便、周期短、成本低廉。其核心不足在于：仅能扩增已知序列邻近的未知区域，对远距离或复杂重排的检测能力有限；受限制性内切酶选择影响较大，可能存在扩增偏好性；无法提供全基因组层面的整合全景。

2.4

全基因组测序（WGS）

原理：通过对CHO细胞基因组DNA进行随机打断、文库构建和深度测序，获得覆盖全基因组的测序数据，通过与参考基因组比对识别包含外源基因序列的reads，精确定位转基因的整合位置。

示意图：图片由AI生成

无偏倚全景分析

WGS的全基因组覆盖使其能够无偏倚地检测所有整合事件，同时检测整合位点、拷贝数变异和基因组结构变异-。不依赖于对转基因序列的先验假设，是全面基因组表征的“终极”方法。一项研究通过WGS定位了表达高滴度单克隆抗体的重组CHO细胞中随机插入的载体。另一系统研究整合了202个RNA-seq数据集和WGS数据，系统鉴定了CHO细胞中的基因组“热点”位点。

2.5

靶向位点扩增测序（TLA-NGS）

原理：靶向位点扩增（Targeted Locus Amplification, TLA）结合NGS是一种基于邻近连接的技术。通过甲醛交联将空间上邻近的DNA片段交联在一起，进行限制性酶切和连接使邻近DNA片段连接成环状分子，再使用针对转基因的特异性引物进行PCR扩增富集包含转基因及其侧翼基因组序列的DNA文库，最后通过NGS测序获得整合位点的精确序列信息。

TLA提供了比传统方法更准确的转基因整合位点遗传表征，是CHO生产克隆早期全面评估的重要工具-。TLA-based靶向测序是传统转基因细胞系分析技术的高性价比高质量替代方案。

图片出处：2014 Targeted sequencing by proximity ligation for comprehensive variant detection and local haplotyping

示意图：图片由AI生成

NGS方法的优势与挑战

NGS方法的共同优势是高分辨率（单碱基级别）、多信息并行（整合位点+拷贝数+结构变异）。挑战在于成本较高、数据分析复杂、对低丰度整合事件的检测灵敏度依赖于测序深度。

2.6

长读长测序方法-Nanopore Cas9靶向测序

原理：nCats管道结合CRISPR/Cas9靶向富集与Oxford Nanopore长读长测序技术。通过Cas9/sgRNA复合物在目标位点切割后，对富集的DNA片段进行纳米孔测序。

图片出处：2023 Nanopore Cas9-targeted sequencing enables accurate and simultaneous identification of transgene integration sites, their structure and epigenetic status in recombinant Chinese hamster ovary cells

示意图：图片由AI生成

长读长跨越复杂串联结构

长读长（可达数十kb）可跨越完整的串联重复和复杂整合结构，对多拷贝串联、基因组重排等复杂整合位点的解析能力远超短读长测序。

同时获得整合位点、序列组成与DNA甲基化状态：nCats管道的独特优势在于——可从同一次测序运行中同时获得整合位点、整合序列组成及DNA甲基化状态。

一项研究结合CRISPR/Cas9靶向富集、纳米孔测序和Canu de novo组装流程，完整重构了两个CHO生产细胞株的整个整合位点。长读长测序获得的完整串联体结构使得对复杂Southern blot数据的全面解读成为可能。与TLA-seq数据的比较证实了基因组断点，但TLA-seq遗漏了大部分载体-载体融合断点。

2.7

方法对比总表

注：“监管认可”等级反映该方法在监管申报中被接受的程度。“渐增”表示NGS-based方法正逐步获得监管机构认可。

方法	分辨率	通量	成本	时间	监管认可	适用场景
Southern blot	中等（kb级）	低	中	长（数周）	高	MCB/WCB鉴定、监管申报
FISH	染色体级	低	中	中（1-2天）	高	单克隆性验证、染色体定位
Junction-PCR	单碱基	中	低	短	中	单克隆性验证
WGS	单碱基	高	高	长	高	全面基因组表征
TLA-NGS	单碱基	高	中高	中	渐增	复杂整合解析、全面评估
长读长测序	单碱基	中	高	中	新兴	串联/重排解析、复杂结构

三

整合位点分析方法的选择策略

3.1

根据研发类型与阶段选择

应用场景	推荐方法	理由
研发早期（细胞株筛选）	PCR-based方法	通量需求中等但时间紧迫，需快速从大量候选克隆中初步评估整合情况。PCR方法操作简便、成本低廉、周期短，适合早期筛选阶段。
MCB/WCB常规鉴定	Southern blot + FISH	监管机构要求MCB和EOPC两个时间点的遗传稳定性分析。Southern blot是监管申报的“金标准”，FISH提供染色体水平的单克隆性验证，两者联合构成正交验证策略。
复杂整合解析（串联/重排/多拷贝）	长读长测序 / TLA-NGS	长读长测序可跨越完整的串联重复和复杂整合结构；TLA-NGS可精确定位整合位点并检测结构变异。短读长测序（如WGS）在解析复杂串联重复时存在局限，而长读长测序可完整重构整个整合位点。
传代稳定性监控	TLA-NGS追踪整合位点变化	TLA-NGS可在不同传代时间点精确追踪整合位点的变化
全面基因组表征	WGS + 转录组联合分析	WGS提供无偏倚的全基因组整合全景，转录组分析揭示整合位点对邻近基因表达的影响；多组学整合可系统鉴定基因组“热点”。
双载体/多基因共转染系统	TLA-NGS / WGS / 长读长测序	多基因共转染可能产生多个独立整合位点和复杂的载体-载体融合，需区分多个载体独立整合位点的高分辨率方法。TLA-NGS可区分不同载体的整合事件，长读长测序可解析载体-载体融合结构。
跨平台比较验证	NGS方法 + Southern blot正交验证	NGS-based方法正逐步获得监管认可。为增强数据可靠性和监管接受度，建议采用NGS方法（TLA-NGS /WGS）与Southern blot进行交叉验证。

3.2

根据申报阶段与复杂程度选择

细分场景	通量要求	推荐方法	核心决策依据
研发早期（初筛）	中通量	PCR-based方法	时间紧迫，需快速从大量候选克隆中淘汰阴性/非稳定克隆，经济快速。
研发早期（单克隆确认）	低通量	FISH / 单细胞整合分析	验证单克隆来源和染色体定位，确保起始细胞株的单一性。
IND申报（MCB/WCB质控）	低-中通量	Southern blot + FISH	监管机构明确要求的“金标准”组合，用于遗传稳定性分析，认可度高。
BLA申报（全面验证）	中-高通量	Southern blot + NGS-based（正交验证）	在满足监管基础上引入NGS（如TLA/WGS），提供更全面的基因组覆盖和正交佐证。
简单整合（单一位点）	不限	Southern blot / FISH	经典方法足以清晰界定整合边界和拷贝数，无需复杂测序。
复杂整合（串联/重排/多拷贝）	不限	长读长测序 / TLA-NGS	短读长无法跨越重复区域，需长读长或TLA-NGS完整重构复杂结构。
复杂整合 + IND/BLA阶段	不限	Southern blot + 长读长/TLA-NGS	以Southern满足监管底线，同时用高分辨技术解析复杂结构，实现互补验证。

四

总结

CHO细胞整合位点分析技术已从Southern blot、FISH等传统方法，演进到NGS-based高通量方法，直至当前长读长测序与多组学联合的前沿方法。每一类方法各有其适用范围：

传统方法（Southern blot、FISH）在监管申报中仍常用——它们是被ICH Q5B、FDA、EMA、中国药典等监管文件明确认可的“金标准”。特别是Southern blot，仍是遗传表征监管申报的必要前提。

NGS-based方法正逐步获得监管认可，代表未来方向——欧洲药典5.14已明确将NGS列为可接受的遗传稳定性分析技术。

长读长测序在复杂整合解析中具有独特价值——可完整重构整个整合位点，解析短读长测序无法跨越的串联重复和载体-载体融合结构。

在实践中，没有“一刀切”的最佳方法。应根据研发阶段、通量需求、整合复杂度和监管要求，组合使用多种方法，在成本、效率和数据质量之间取得优选平衡。随着测序成本的持续下降和生信分析流程的日臻完善，NGS-based方法将在CHO整合位点分析中扮演越来越重要的角色，推动细胞株开发向更精准、更高效的方向发展。

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参考资料：

1. ICH Q5B: Quality of Biotechnological Products: Analysis of the Expression Construct in Cell Lines Used for Production of r-DNA Derived Protein Products, Step 4 version (1995).

2. ICH Q5D: Derivation and Characterisation of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products.

3. FDA (1993). Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Used to Produce Biologicals.

4. European Pharmacopoeia 5.14: Cell Substrates for the Production of Biotechnological/Biological Products.

5. 中国药典（2020版）人用重组DNA蛋白制品总论.

6. 中国药典（2025版）0234 生物制品生产用动物细胞基质制备及质量控制.

7. EMA Guideline on the quality of biological active substances produced by stable transgene expression in CHO cells.

8. Jeong HY, Devine C, Lin BR, et al. Optimized Southern blotting for enhanced and precise detection of transgenes in CHO cells from transposon-based expression systems. Biotechniques, 2026.

9. Huang Z, Jeong HY, Nelson L, et al. Next-Generation Sequencing-Based In Silico Transgene Integration Profiling Tool Accelerates Cell Line Genetic Characterizations. Biotechnology Journal, 2025, 20(3): e202400675.

10. O'Brien SA, Leinas JT, Grantham J, et al. Application of Targeted Sequence Capture (TSC) for Genetic Characterization of Antibody Producing Cell Lines. Biotechnology Journal, 2026.

11. Clappier C, Böttner D, Heinzelmann D, et al. Deciphering integration loci of CHO manufacturing cell lines using long read nanopore sequencing. New Biotechnology, 2023.-

12. Marx N, Leitner K, Motheramgari K, Borth N. Nanopore Cas9-targeted sequencing enables accurate and simultaneous identification of transgene integration sites, their structure and epigenetic status in recombinant Chinese hamster ovary cells, 2022.-

13. Structural analysis of random transgene integration in CHO manufacturing cell lines by targeted sequencing. PMC, 2022.-

14. Systematic identification of genomic hotspots for high-yield protein production in CHO cells. New Biotechnology, 2025.-

15. Revisiting the impact of genomic hot spots: C12orf35 locus as a hot spot and engineering target. PubMed, 2024.-

16. CRISPR/Cas9-mediated site-specific integration (SSI) to incorporate a landing pad at a genomic hotspot (Fer1L4). KCI, 2021.

17. Efficient site-specific integration in CHO-K1 cells using CRISPR/Cas9-modified donors. Molecular Biology Reports, 2023.

18. Enhancing stability of recombinant CHO cells by CRISPR/Cas9-mediated site-specific integration into regions with distinct histone modifications, 2024.

19. Epigenomic features revealed by ATAC-seq impact transgene expression in CHO cells. Biotechnology Journal, 2021.

20. Stability and transcriptomic study of C12orf35 site-specific integrated CHO cell line (PRJNA839086).

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