粘稠堵膜样品如何选择无菌检查方法:以玻尿酸注射剂的无菌检查方法建立为例

透明质酸钠注射液（俗称玻尿酸注射剂）有两个特点，一是黏。高浓度透明质酸溶液有很高的黏度，滤膜容易被堵。二是它自己就能抑菌——已有研究报道透明质酸在0.5 mg/mL及以上时，会轻微抑制若干细菌和真菌的生长。

当选择无菌检查方法时，这两个问题一起出现，问题就变成：这瓶注射液到底该用直接接种法，还是薄膜过滤法？

直接接种法会把产品一起带进培养基，产品自身的抑菌性可能抑制微生物，从而出现假阴性；薄膜过滤法能把产品冲走抑菌活性去除问题可以解决，但前提是它要能通过滤膜，事实上，黏稠体系可能根本过不去膜。下面以25 mg/2.5 mL透明质酸钠关节腔内注射剂无菌检查方法选择为例，讨论方法如何选择？

一、透明质酸钠的特殊身份

《日本药典》收载了"精制透明质酸钠注射液"这一品种，来源可以是鸡冠或微生物发酵。但《欧洲药典》和《美国药典》的各论里未收载。在欧美，这类产品被归为医疗器械——理由是它通过机械方式为关节软骨和滑膜提供润滑与缓冲。

身份差异来自对作用机制认识的迭代。近年有研究陆续报道透明质酸还具有抗炎、镇痛和软骨保护作用。基于这些治疗作用，FDA在2018年的联邦公报中公告：用于骨关节炎的透明质酸关节腔内产品，可能不符合医疗器械的定义。

这里涉及一个更实际的问题：同一支产品，在不同监管体系里走的是两套不同的检验标准。

药典体系覆盖药品，《日本药典》《美国药典》《欧洲药典》都不管已灭菌的医疗器械。医疗器械的无菌检查走的是ISO 11737-2:2019。

ISO 11737-2:2019里描述的三种方法：直接浸没、先洗脱表面微生物再浸没或膜过滤、以及液体产品的过滤。第三种方法是新近才加进去的。医疗器械表面的微生物洗脱往往效率不高，所以直接浸没法更实用；而液体产品不存在这个问题，过滤法就变得可行。

《日本药典》对精制透明质酸钠注射液的无菌检查，要求使用直接接种法。这类产品本身是可过滤的液体，符合薄膜过滤法的适用条件，在FDA重新考虑分类的背景下，薄膜过滤法似乎又是可以使用的。

二、两种方法的操作差别

直接接种法与薄膜过滤法的区别见下表。

三、第一个坑：产品的抑菌活性

直接接种法的设计前提是：产品进入培养基后，不能妨碍微生物生长。所以在方法适用性试验之前，先做了一件事——测出这个产品最多能往培养基里加多少。

实验用6株标准菌，分装在两种培养基里（FTM：生孢梭菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌；TSB：黑曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌），每株接种约30 CFU。

透明质酸在培养基中的终浓度设了四个水平：1、0.5、0.25、0.1 mg/mL，另设不含透明质酸的阳性对照和含透明质酸但不接种的阴性对照。

结果如下表：

 绿假单胞菌1 mg/mL时生长正常，到0.5 mg/mL反而出现轻微抑制。铜绿假单胞菌形成的菌层厚度随透明质酸浓度变化，这说明透明质酸确实对它有影响。有研究显示：透明质酸在0.5 mg/mL及以上时对细菌和真菌生长有轻微阻碍，涉及金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、变形链球菌、大肠埃希菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和铜绿假单胞菌；具体的抑制机制尚不清楚。

综上，可以将直接接种法的透明质酸上限浓度定为0.25 mg/mL。这条线看起来是个技术参数，实际上直接决定了取样量。产品的透明质酸浓度是10 mg/mL，要在10 mL培养基中把终浓度控制在0.25 mg/mL，能加进去的产品体积其实是极其有限的。产品的抑菌性越强，允许加入的样品量就越小，取样代表性就越差——这正是抑菌性产品做无菌检查时的固有矛盾。

四、第二个坑：黏稠产品怎么过滤？

薄膜过滤法的方案是：

取20支注射剂，合计50 mL，稀释到300 mL的 D稀释液（Fluid D）中。D稀释液就是0.1%蛋白胨加入0.1%聚山梨酯80的溶液。

稀释后的溶液经含两张0.45 µm混合纤维素酯滤膜的过滤器，滤膜用100 mL Fluid D洗2次。

洗完后：一张滤膜用含菌的100 mL Fluid A冲洗，另一张用不含菌的Fluid A冲洗，随后两个滤器分别灌入FTM和TSB。

结果：稀释后的混合液顺利通过0.45 µm滤膜，没有堵塞滤膜。

直接接种法试验中提示的抑菌成分（在透明质酸浓度≥0.5 mg/mL时出现），在过滤和洗膜步骤中被去除掉了。所有试验菌在过滤和洗膜之后都实现了充分生长。

聚山梨酯80在这里起的是分散与润湿作用，用来对付透明质酸的高黏度；两次洗膜则把残留在膜上的抑菌成分冲走。洗膜这一步同时接受了两项考验：抑菌成分要洗掉，微生物要留住。

五、第三个坑：真菌生长的判断

方法适用性试验的判断环节藏着一个容易被忽略的细节。

枯草芽孢杆菌的生长很好认，培养基浊度明显上升。真菌就不是这样了：

黑曲霉在培养基中形成的是菌丝体，白色念珠菌长出来的是管底沉淀。

这两种生长形态，用"培养基是否变浑浊"这一条标准去判读，很容易漏掉。

对做无菌检查的实验室来说：无菌检查的判读标准是浑浊，但不同微生物的表现形式不一样，特别是真菌。判定"无生长"之前，管底沉淀、管壁附着、菌丝团这些非典型表现都要看一遍。

六、两种方法的结果对比

方法适用性试验的结果见下表：

各菌株的接种量都在100 CFU以下，符合药典对促生长试验和方法适用性试验的接种量限制。细菌3天内生长，真菌5天内生长。阴性对照培养14天全部无生长。

七、局限

第一，其他厂家的产品没有测。研究所用产品对应25 mg透明质酸/2.5 mL，因此这里描述的薄膜过滤法适合于该产品，并不代表其他产品也可以用该方法；由于没有评估其他厂家的产品，每个透明质酸注射液产品都需要各自确认方法适用性。

第二，薄膜过滤法结论有前提。这一方法成立的基础是产品可过滤。稀释倍数、稀释液配方、洗膜体积和次数，都建立在"产品能被滤过"这个前提上。换个黏度更高的规格，方案要重新开发。

结束语

透明质酸钠注射液的例子揭示了无菌检查方法选择的逻辑：检验方法的选择取决于产品自身特性和抑菌活性。产品的抑菌性决定它能加多少进培养基，产品的黏度决定它能不能过膜，这些需要从自己的产品中做实验才能得到。

相关文章推荐