质粒
把编码Cas9与sgRNA的DNA质粒送进细胞，由细胞自行转录翻译出编辑工具。
操作门槛最低、载荷不受载体容量限制，也不必引入病毒；代价是CRISPR质粒体积超过10kb，常规转染效率偏低，且表达可维持数天到数周，脱靶暴露窗口相应拉长。
在固有免疫机制完整的原代细胞中，裸露质粒DNA还可能引发干扰素反应从而影响效率。
RNP
把Cas9蛋白与化学修饰的sgRNA在体外预先组装成复合物，再用电穿孔送进细胞。
它不经过转录翻译环节，进入细胞后即可发挥活性，约12至24小时完成切割并被清除，是编辑窗口最短的一类；代价是蛋白与修饰RNA成本较高，且依赖电转设备。
在难转染细胞中普遍可获得超过50%的编辑效率。
慢病毒
整合型载体，把编辑工具的遗传信息整合进受体细胞基因组，随细胞分裂长期稳定表达。
四类中适合全基因组功能筛选的是它，建立稳定敲除细胞系也常用这条路线；代价是整合本身带来插入突变风险，持续表达同时把脱靶活性存在的时间窗口拉长
AAV
以游离体形式长期存在于细胞核内，不整合进基因组，可按血清型选择以实现一定的组织选择性。
主要约束在容量：外源DNA包装上限约4.8kb，而SpCas9的编码序列约4.1kb，使用SpCas9时通常需要拆成两个载体或采用一体化设计；自互补AAV容量仅约2.4kb，装不下Cas9。
编辑窗口越短，脱靶暴露越少，但通常也意味着操作成本更高、载荷能力更受限；载荷能力越大、表达越持久，长期风险也随之上升。
在实际中应如何决策？
载体选择应该从实验终点往回推，而不是从手头已有的材料往前推。以下是常见终点的对应分支。终点是拿到一个不再表达Cas9的敲除细胞（瞬时编辑）- 细胞易转染，如HEK293等细胞系：质粒转染即可。
- 细胞难转染，如原代T细胞、原代成纤维细胞、hiPSC：电穿孔RNP。
- 目标是体积较大的肿瘤细胞、且希望避开病毒载体：纳米颗粒包被质粒（RRPHC类方案）。
- 只是想先比较几条gRNA的活性：AAV粗裂解物配合T7E1，约一周出结果。
- RNP配合约100nt的单链寡核苷酸模板电转，突变位点尽量控制在切口两侧各10nt以内[1]。
- 慢病毒。建立稳定敲除细胞系用单载体或双载体系统，做文库筛选用慢病毒文库；双载体系统建议在MOI为0.1至0.3的条件下转导，以控制整合拷贝数[1]。
- 肝脏、需要批量建立模型、对成本敏感：水动力尾静脉注射裸质粒，转染约5%至40%的肝细胞，3周左右即可建立一批模型[1]。
- 面向治疗级应用：需要先解决Cas9的免疫原性问题。人群体中约65%对SpCas9、约79%对SaCas9血清学阳性，持续表达Cas9可能导致编辑细胞被免疫清除[1,3]。
选择递送工具这件事，我认为不存在普适最优的递送方式，只有与实验目标匹配的选择。如果要把它压缩成一条可复用的顺序，可以按这个思路来走：先确定编辑窗口需要多长，再看目标细胞好不好进，最后按下游对编辑结果的要求筛掉不合适项。这三步走完，剩下的选项通常只有一到两个，此时再去看具体参数才有意义。参考资料
[1] 《CRISPR Gene Editing: Methods and Protocols》读书笔记，第09章电穿孔递送Cas9蛋白与修饰sgRNA[2] Xue W, Chen S, Yin H, et al. CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver.Nature. 2014;514(7522):380-384. doi:10.1038/nature13589[3] Yin H, Xue W, Chen S, et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.Nature Biotechnology. 2014;32(6):551-553. doi:10.1038/nbt.2884
